显微荧光成像质量主要取决于像的衬度和像的亮度, 像的衬度是由样品中激发出的荧光与背景上观察到的光之比决定的。背景光包括透过截止激发光的滤色片的杂散激发光, 样品组织成分的自发荧光和光学系统的自发荧光和杂散光, 在荧光显微术中尽全力要解决的是既获得最佳的像衬度, 同时又维持像有足够亮度, 这两者往往是矛盾的。例如用极窄波带滤色片激发时仅利用了极少的光能, 背景暗了但荧光亮度也弱了。在应用时, 只能兼顾, 合理的权衡以决定取舍。
荧光显微光学系统需要优先考虑的是:
(1) 光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料, 不但指光学系统玻璃也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光, 不但会增加背景光, 有时还会混淆观察荧光图像。
(2) 光学系统的参数选择中, 应将获得最大光能作为第一考虑因素。
照明系统中集光镜应选用最大的包容角; 采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳, 以期望获得高效率的均匀照明。
收集荧光成像的物镜, 因为像面照度与数值孔径NA 2 成正式, 为此作为荧光用物镜应有较大的NA值。目前10×已达015; 20×达0175; 40×达019; 油镜40×达113。
双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率, 采用镀膜技术可大大地减少光能的损失, 它可比一般双目镜筒透射率提高一倍, 这对弱荧光物质观察是必须的。
目镜放大率不宜选大, 因为象面照度与目镜放大率平方成反比。若其它条件相同, 当用613×目镜时,照度定为100% , 换上1215×时, 照度约为25% , 因此常在4×～ 613×之间选用。
由此表明, 用不同物镜和目镜组合成同一倍率的显微镜时, 象面照度和曝光系数可相差数倍, 对于荧光观察最佳组合是选用低倍率目镜和NA 大的物镜最为合适。
(3) 作为荧光光学系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的, 特别是紫外光要通过的部件, 如照明系统, 聚光镜以及物镜, 要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料。照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好, 因为铝在UV 和V 区反射率在90% 以上, 而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线, 在紫外区通过处不宜用作胶合剂。
